image: Schematic diagram of homogeneous electrochemical strategy based on multi-marker and molecular filler-enhanced DNA nanospheres for ctDNA analysis and metastasis-associated assessment. Figure was created by BioRender.
Credit: ©Science Bulletin
循环肿瘤DNA（ctDNA）液体活检技术通过检测肿瘤细胞释放至血液中的DNA片段，为肿瘤的早期诊断、疗效监测及个体化治疗提供了一种非侵入性、实时获取分子信息的途径。然而，与大量来源于非肿瘤细胞的DNA相比，肿瘤来源的DNA片段通常含量极低，使其可靠检测面临较大挑战。因此，开发兼具高灵敏度与简便操作流程的检测方法，有望为现有液体活检技术提供有益补充。近日，四川大学华西医院研究团队开发了一种小分子填充剂增强的DNA纳米机器，通过改善传感性能，将特定DNA序列的识别事件转化为电化学信号，实现了无需DNA扩增、酶促反应或靶标标记的双重ctDNA突变同步检测。
研究人员利用DNA链自组装及Ag+或Hg2+离子介导的配位作用，构建了纳米尺度的DNA结构。其中，Ag+和Hg2+作为电化学信号报告分子，能够产生可区分的特征电信号。当特定靶标DNA与纳米结构结合时，可触发DNA纳米机器解组装，释放相应的金属离子，从而实现对靶标的定量检测。为进一步提升DNA纳米机器的传感性能，研究团队筛选了多种具有不同DNA相互作用特性的小分子填充剂，系统评估了其与DNA的结合特性、负载能力，以及对纳米结构稳定性和信号报告离子保留能力的影响。研究发现，亚甲基蓝（MB）的引入能够有效抑制金属离子的非特异性泄漏，降低背景信号，使分析灵敏度较未添加填充剂的体系提高100倍，信噪比提升2.5倍。 基于该策略构建的检测体系，对EGFR L858R和T790M突变的检测限分别达到5.2和6.0 amol/L。此外，该方法简化了样本处理流程，血浆样本仅需经过稀释和加热处理，靶标反应的孵育时间为60分钟。
研究团队进一步利用66例未经治疗的非转移性非小细胞肺癌（NSCLC）患者的血浆样本开展临床验证，并以定量PCR（qPCR）检测结果作为参照标准。在区分qPCR阳性与阴性样本方面，EGFR L858R和T790M两种突变检测的受试者工作特征曲线下面积（AUC）均达到0.96，表明该平台具有良好的突变识别能力。然而，在区分肺癌患者与健康人群方面，两种突变的检测表现受到其发生率及生物学作用的影响。L858R突变存在于部分非小细胞肺癌患者中，而T790M突变主要与EGFR靶向治疗后的获得性耐药相关，在未经治疗的患者中发生率较低。与30例健康对照者相比，L858R相关信号区分肺癌患者与健康人群的灵敏度为54.5%，特异性为100%。相比之下，T790M相关信号的区分能力有限，AUC仅为0.52，这与该突变在未经治疗患者队列中的低发生率相一致。未来仍需纳入更大规模的EGFR靶向治疗患者队列，以进一步评估该平台在肿瘤耐药监测中的应用潜力。
此外，研究人员还将该平台拓展应用于甲状腺乳头状癌相关的BRAF V600E突变检测。在38例患者血浆样本中，该方法与扩增阻滞突变系统定量PCR（ARMS-qPCR）检测结果的总体一致率达到94.7%，突变检测的AUC达到0.97，进一步证明了该平台对不同肿瘤相关分子靶标的良好适用性。
探索性临床分析还发现，转移性与非转移性患者群体之间的突变相关信号存在一定差异，提示该平台在未来肿瘤疾病监测中具有潜在应用价值。然而，这些初步发现仍需通过更大规模的纵向临床研究进一步验证，同时应充分考虑肿瘤负荷、疾病分期及既往治疗史等因素对检测结果的影响。
未来，研究团队将重点拓展该平台可检测的突变靶标范围，优化DNA纳米结构及信号报告体系，以实现更高通量的多重检测，并推动其与小型化电化学检测设备的集成。同时，通过开展更大规模的纵向临床研究，有望进一步明确该平台在肿瘤治疗反应监测及获得性耐药早期识别中的应用价值，为肿瘤的快速分子分析与个体化精准诊疗提供新的技术支持。