image: Twenty of the isolated fungi with action against X. citri belonged to the genus Pseudogymnoascus and were extracted from terrestrial and marine samples. Next came Penicillium (five), followed by Cadophora (two), Paraconiothyrium (one) and Toxicocladosporium (one), all extracted from marine sediments. view more
Credit: Daiane Cristina Sass (IB-UNESP)
Uma equipe de pesquisadores do Instituto de Biociências da Universidade Estadual Paulista (Unesp) em Rio Claro, Brasil, identificou 29 fungos com ação comprovada contra Xanthomonas citri, a bactéria causadora do cancro cítrico, doença que ocorre de forma endêmica em todos os países produtores de citros. E a origem desses fungos é surpreendente: eles foram isolados de amostras de solo e de sedimento marinho da Antártica.
"Esses fungos vivem em condições de isolamento e se proliferam em ambientes inóspitos, com baixas temperaturas e elevado índice de radiação ultravioleta", explica Daiane Cristina Sass, professora da Unesp e coordenadora de projeto que busca microrganismos que produzam compostos com ação antibacteriana para aplicação na agricultura, e que tem apoio pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo - FAPESP.
"Quais seriam as suas adaptações para conseguir sobreviver em um ambiente tão hostil à vida? Queríamos ver se tais fungos produzem moléculas com estruturas únicas, capazes de protegê-los de infecções e que, portanto, teriam ação antibacteriana." Sass assina em conjunto com os colegas do instituto Lara Durães Sette e Henrique Ferreira, entre outros, um artigo em Letters in Applied Microbiology que traz alguns dos resultados da pesquisa.
Mais eficácia no combate ao cancro cítrico
Embora haja algumas formas de combate, nenhuma delas tem total eficácia na eliminação da doença. Daí ser essencial a busca de novos métodos químicos ou biológicos para proteger os pomares.
O controle da doença é feito pelos próprios citricultores. São indicadas medidas como pulverizações do pomar com produtos à base de cobre e a substituição de plantas infectadas por mudas sadias e de variedades mais resistentes. Além disso, recomenda-se o controle da larva minadora ou minador-dos-citros (Phyllocnistis citrella). Trata-se de uma mariposa cujas larvas provocam ferimentos na planta, abrindo entradas para a penetração da bactéria do cancro cítrico.
"O principal método de combate ao cancro cítrico é a aplicação nos pomares de compostos de cobre. O lado negativo é que, mesmo em quantidades pequenas, com o uso prolongado o cobre acaba por se acumular nos frutos, no solo e nas águas, acabando por contaminar todo o meio ambiente. É por isso que buscamos novos compostos que sejam menos agressivos ao meio ambiente e menos prejudiciais ao ser humano", disse Sass.
Coleta e isolamento do fungo antártico
No âmbito das investigações em biotecnologia do projeto coordenado por Sass, surgiu a ideia de investigar a coleção de fungos estruturada pela Professora Sette ao longo de expedições realizadas durante os verões antárticos de 2013 e 2015 no arquipélago das Shetland do Sul, que se insere no projeto Microsfera, vinculado ao Programa Antártico Brasileiro (Proantar) e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq).
Sette conduz o projeto "Micologia marinha e Antártica: diversidade e aplicação ambiental", também com apoio da FAPESP.
Na ilha Deception, Sette isolou 33 fungos filamentosos a partir de amostras coletadas em solo abaixo de madeira podre. Já nas águas da baía do Almirantado, na Ilha Rei George, foram isolados 53 fungos filamentosos de sedimentos marinhos, localizados a 20 metros de profundidade. Todas as linhagens de fungos estão depositadas na coleção do Instituto de Biociências intitulada Central de Recursos Microbianos da Unesp (CRM-Unesp).
Dentre os 86 fungos isolados na Antártica, o estudo apoiado pela FAPESP verificou que 29 (19 de origem marinha e 10 terrestres) têm compostos de comprovada ação antibacteriana contra Xanthomonas citri.
O trabalho para o isolamento dos compostos produzidos pelos fungos e a verificação da sua atividade antibacteriana envolve diversas etapas. O processo inicia com o isolamento dos fungos, seguido do crescimento destes por vários dias em placas de cultura com nutrientes.
Os fungos são então cultivados por vários dias em meio líquido com meio de cultura a temperatura controlada de 15 °C e com agitação. A biomassa sólida e a parte líquida são separadas, e as duas partes são submetidas a extração com solventes para se obter os extratos intracelulares e extracelulares.
Testes
Ao todo, foram obtidos 158 extratos. Cada extrato foi diluído em diversas concentrações (2,10 mg/ml a 0,02 mg/ml), que foram por sua vez testadas contra Xanthomonas. No caso dos fungos do solo, a maioria dos extratos com ação antibacteriana contra o agente causador do cancro cítrico é de origem intracelular. Já no caso dos fungos marinhos, só houve atividade com os extratos extracelulares.
"Queríamos verificar qual seria a concentração mínima de cada extrato capaz de inibir em 90% dos casos o crescimento de Xanthomonas", disse Sass.
Parte dos extratos (12) foi capaz de afetar o crescimento bacteriano em concentrações menores do que a máxima testada, sendo que 10 desses extratos apresentaram resultados superiores a 90% de inibição do crescimento de Xanthomonas em concentração de 1,5 mg/ml a 1,0 mg/ml.
"Na concentração máxima, houve extrato que conseguiu inibir a reprodução de Xanthomonas em até 98%, e um outro extrato que apresentou resultados em torno de 80% na concentração de 0,52 mg/ml", disse Saas. "Cabe salientar que estamos falando de extratos [que apresentam variada quantidade de moléculas]. Assim, se no extrato apenas um composto for o responsável por esta bioatividade, este composto poderá apresentar uma boa atividade antibacteriana em concentrações bem menores", acrescenta.
Vinte dos fungos isolados com ação contra Xanthomonas citri pertence ao gênero Pseudogymnoascus e foi extraída das amostras terrestres e marinhas. Em segundo lugar veio o gênero da penicilina, Penicillium (cinco), seguido por Cadophora (dois), Paraconiothyrium (um) e Toxicocladosporium (um), todos extraídos de sedimentos marinhos.
Uma vez identificados os extratos com ação contra Xanthomonas, os pesquisadores procuram agora saber quais são os compostos químicos presentes nos extratos e que lhes conferem ação antibacteriana.
"Estimamos que em até um ano e meio deveremos ter identificado, purificado e realizado testes toxicológicos para alguns desses compostos bioativos", disse Sass.
Os pesquisadores esperam patentear os compostos identificados. Ao mesmo tempo, desejam conseguir sensibilizar indústrias voltadas para o setor agrícola para desenvolver, a partir desses extratos, produtos de uso comercial para o combate ao cancro cítrico.
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Journal
Letters in Applied Microbiology